PRUEBAS BIOQUIMICAS.

El metabolismo microbiano es el conjunto de procesos por los cuales un microorganismo obtiene la energía y los nutrientes (carbono, por ejemplo) que necesita para vivir y reproducirse. Los microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias metabólicas distintas y las especies pueden a menudo distinguirse en base a estas estrategias. Las características metabólicas específicas de un microorganismo constituyen el principal criterio para determinar su papel ecológico, su responsabilidad en los ciclos biogeoquímicos y su utilidad en los procesos industriales. (1)
Algunas pruebas bioquímicas que se realizan para identificación de microorganismos:

CITRATO: Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH.

UREASA. Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.
Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.

ROJO METILO: Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.
Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

Indol: mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa. Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de kovac`s que se puede preparar con los siguientes ingredientes:
Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml
p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g
HCl (concentrado).........................................................................50ml
TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro): El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la detección de la producción de H2S. Es un medio útil para la identificación de enterobacterias.

LIA (agar lisina hierro): este ensayo permite diferenciar los microorganismos que producen descarboxilación o desanimación de la lisina. Se puede detectar además la producción de h2s. Es muy utilizado en las técnicas de búsqueda de salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.
Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible en un sistema analítico adecuado. se cree que la coagulasa funciona en vivo, produciendo una barrera en el sitio de infección estafilocócica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus.

VOGUES PROSKAUER: En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

CATALASA: El objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa. El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias lo eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + ½ O2).

NITRATO: Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final.
Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros Haemophylus y Neisseria.

DNASA – DESOXIRRIBONUCLEASA: la actividad desoxirribonucleasa (dnasa) se ha demostrado fundamentalmente en los géneros Staphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el adn a fracciones de menor peso molecular. esta característica se ha utilizado para identificar las especies de Serratia Marcescens y Staphylococcus aureus. weckman y catlin demostraron la estrecha correlación entre la producción de DNasa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la producción de coagulasa.
Agar Sangre:
Medio de propósito general para el cultivo de una gran variedad de microorganismos incluyendo los exigentes. Al añadirle sangre, puede utilizarse para la determinación de las reacciones hemolíticas. El medio esta libre de azucares reductores, ya que estos influirían de forma adversa en reacciones hemolíticas. El crecimiento en agar sangre puede producir cambios en el aspecto del medio
Alrededor de las colonias. Esto es debido a que los eritrocitos pueden ser lisados por
Las células microbianas, total o parcialmente, lo que da lugar 3 tipos diferentes de
Hemólisis:
a) β-hemólisis: los eritrocitos se lisan totalmente y la hemoglobina es degradada
dando lugar a un halo claro alrededor de las colonias. Hemólisis total.
b) α-hemólisis: aparición de una zona marrón-verdosa alrededor de las colonias
Debido a la una lisis incompleta de los eritrocitos con cambio de color de la
Hemoglobina por pérdida de potasio. Hemólisis parcial.
c) γ-hemólisis o no hemólisis. No hay cambio alrededor del crecimiento microbiano.

O.F (OXIDACIÒN FERMENTACIÒN): Las bacterias utilizan los hidratos de carbono por uno de dos procesos metabólicos, fermentativo u oxidativo. Algunas bacterias pueden metabolizar un hidrato de carbono (como se demuestra la producción de ácido) solo en condiciones aerobias, mientras que otras producen ácido tanto aerobio como anaerobio.
La fermentación es un proceso anaerobio que requiere la fosforilaciòn inicial de la glucosa antes de la degradación a una mezcla de ácidos relativamente fuertes, mientras que la oxidación en ausencia de compuestos inorgánicos como el nitrato y el sulfato, es un proceso aerobio estricto que involucra la oxidación directa de una molécula no fosforilada de glucosa (inicialmente). La fermentación produce mayor acidez que la oxidación. La principal diferencia entre el metabolismo fermentativo y metabolismo oxidativo de un hidrato de carbono es el requerimiento de oxigeno atmosférico y la fosforilaciòn inicial.

ANTIBIOGRAMA: Consiste en el estudio de la sensibilidad o resistencia de determinado microorganismo (o grupo de ellos) a varios antibióticos. Se puede utilizar para tratar un patógeno, añadir a alimentos, en definitiva para saber como se comporta un germen frente a determinado antibiótico.
Los antibióticos en general pueden ser de amplio espectro o de espectro reducido, estos últimos van a matar gérmenes más específicamente. Dependiendo del origen o localización de la infección, se va a utilizar uno u otro. Por ejemplo en una infección de garganta no se debería utilizar uno de amplio espectro ya que mataría también a la microbiota tan importante para nosotros.
El antibiograma se puede hacer tanto en medio líquido como en medio sólido. En nuestro caso vamos a utilizar un agar ordinario pero modificado de manera que gérmenes y antibióticos puedan difundir correctamente: agar de Muëller-Hinton.
Se utilizan para poner los antibióticos, unos discos impregnados que llevan unas letras que nos indican el antibiótico del que se trata y un número que indica la concentración en mg/ml que tenía la disolución en la que se impregnaron.

GELATINA: Se usa para valorar la licuefacción o licuación de la gelatina por acción de las gelatinasas bacterianas producidas por algunas Enterobacterias. La reacción positiva hace que el medio permanezca líquido después de la incubación aún después de dejarse en refrigeración durante media hora. La reacción negativa permite nuevamente la solidificación.
PROTEASAS O GELATINASAS (+):En esta prueba se determina la producción de enzimas de carácter proteolítico en un medio nutritivo de gelatina. En el video se observa la prueba de gelatinasas POSTITIVA en donde la gelatina ha sido hridrolisada por proteasas extracelulares de la bacteria. Se observa que la gelatina se licúa (pasó de estado solido a líquido) dado que ha sido hidrolisada hasta aminoácidos individuales. GELATINASAS +.
PROTEASAS O GELATINASAS (-):En esta prueba se determina la producción de enzimas de carácter proteolítico en un medio nutritivo de gelatina. En el video se observa la prueba de gelatinasas NEGATIVA en donde la gelatina continúa siendo un polipeptido y por lo tanto NO hay proteasas extracelulares que puedan degradarla hasta aminoácidos individuales. Se observa que la gelatina continúa en estado Sólido y no pierde su consistencia. GELATINASAS -.

SULFUROS INDOL MOTILIDAD (SIM):Este medio se uriliza para tres pruebas bioquímicas como ya se menciono anteriormente: la del sulfuro de hidrógeno (S) de la misma manera que en el agar Kliger, la del indol (I) y la motilidad (M).
La motilidad (M) a través del medio semisólido se traduce por diseminación de la opacidad bacteriana a partir del trayecto de la picadura de inoculación (reacción positiva). Si la motilidad es negativa, el crecimiento se encuentra restringido al trayecto de la picadura.

HIDRÓLISIS DE LA CASEINA: Esta prueba determina la presencia de proteasas que actúan sobre la caseína presente en el medio generando polipèptidos y/o aminoácidos.